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組織石蠟切片的操作步驟及注意事項
更新時間:2022-07-18   點擊次數(shù):1667次
   石蠟切片是最基本的切片技術,冰凍切片和超薄切片等都是在石蠟切片基礎上發(fā)展起來的。
  詳細操作步驟:
  A 材料預處理:材料切割成適當大小總體積不超過1cm?,例如葉片切成邊長3mm~5mm的方塊,放入帶塞小瓶或離心管48h以上。(瓶中事先裝入適量F.P.A.固定液,要淹沒材料,若是材料浮在液面上,可用棉花將材料壓到液面下。)
  B 梯度酒精脫水:根和莖:50% 3h,70%2h,85%1h,95% 30min,無水乙醇30min。(葉片:50% 3h,70% 12h,85% 1h,95% 1h,無水乙醇1h。)
  C 透明:根和莖:純二甲苯/無水乙醇=1:1(V:V)處理2h,純二甲苯處理1h。(葉片:酒精:二甲苯=1:2處理1h,酒精:二甲苯=1:1處理1h,純二甲苯處理1.5h,于30℃,70r/min的搖床中)(浸到組織塊透明,若不透明,則純二甲苯再處理1次;材料若是變脆的話,可在透明步驟適當減少透明時間)。
  D 浸蠟:根和莖:將上述材料連同純二甲苯一起轉入兩倍體積的純石蠟溶液中,放置于55℃烘箱中24h,使石蠟不凝固沉淀即可。之后將材料用鑷子輕輕夾起放入純石蠟中繼續(xù)浸蠟24h。(葉片:25%石蠟60℃ 1h,50%石蠟60℃ 1h,75%石蠟60℃ 1h,純石蠟60℃ 10h)
  E 包埋:將浸好的材料轉移到已溶解的純石蠟中進行包埋。包埋時有專門的包埋模具,先將熔化的純石蠟倒入模具中,石蠟適當溢出模具中央的槽子,以便于后期取蠟塊;之后用酒精燈已燒熱的鑷子先在浸有材料的石蠟溶液的冷卻一下,之后再將材料夾到包埋槽中進行包埋;隨后將包埋槽置于4℃左右的冰水中迅速冷卻,若出現(xiàn)裂紋,此時就需要重新包埋,步驟同上。
  F 修蠟:將包埋有材料的蠟塊多余部分切掉即可。
  G 切片:將蠟塊固定在蠟座上,將蠟塊放在蠟座上,用手稍微固定,再用酒精燈燒熱的鑷子沿著蠟塊周圍熔化石蠟,之后等石蠟冷卻即可將蠟塊固定在蠟座上。調(diào)整好切片厚度(根莖25um;葉≥95um(葉片包埋的方法不同于其他);肉質根及側根切片厚度12um。)與刀片角度(6°~8°)即可切片,完整的切片應該是材料在單個蠟片上,不能有褶皺。
  H 貼片與撈片:在干凈的載玻片上涂上一層薄的明膠黏貼劑,一般40℃烘箱過夜。將蠟條置于40℃蒸餾水中撈片,之后同樣置于40℃烘箱過夜。明膠黏貼劑配方:明膠1g,苯酚2g,蒸餾水100ml,丙三醇15ml。配法:明膠和蒸餾水一起倒入燒杯中加熱,明膠熔了即可停止加熱,之后再加2g苯酚和15ml丙三醇,攪拌至全溶,紗布過濾,貯存于有蓋瓶中備用。
  I 去蠟:純二甲苯20min,純二甲苯/無水乙醇=1:1(V:V)10min,純二甲苯/無水乙醇=1:2(V:V)5min。
  復水-番紅染色-復水-固綠染色-封片:純酒精30s,95%酒精30s,85%酒精30s,70%酒精30s,60%酒精15s,1%番紅染色12~24h,70%酒精15s,85%酒精15s,固綠染色30s ,95%酒精15s,純酒精15s,酒精:二甲苯=2:1處理2min,酒精:二甲苯=1:1處理2min,純二甲苯5min,最后中性樹膠封片
  注意事項:
  1%番紅染液配方:番紅1g,≥50%酒精100ml,定量濾紙過濾備用/其實質量好的番紅不過濾直接用也行。
  0.1%固綠染液配方:固綠0.1g,95%酒精100ml,定量濾紙過濾備用/其實質量好的番紅不過濾直接用也行。
  脫水與固綠染色:50%酒精20~30s(此時換用稍大一些的燒杯,番紅染色的載玻片上沾有大量翻紅酒液,此時可在大燒杯中洗去載玻片上多余的染色液,以免后續(xù)酒精溶液被染色),70酒精20~30s,85酒精20~30s,95%酒精固綠染色10~15s,95%酒精20~30s(此時95%酒精也可用大一些的燒杯重新配,以便洗去載玻片上多余固綠染液),純酒精20~30s。(材料在高酒精濃度中浸泡時間不宜過長,以免使材料過度脫水造成組織結構變形)
  封片:在載玻片上的材料處滴加適量中性樹膠,再蓋上蓋玻片封片,自然烘干即可顯微觀察。(蓋蓋玻片時,先將蓋玻片一邊固定,對邊緩緩下降,可減少氣泡產(chǎn)生)。
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